为了确定局部照射对肿瘤生长和scs的影响，当肿瘤直径达到7.5时，我们使用大分割rt(20gy/f)治疗皮下llc肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为5003，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的cd11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是cd11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致scs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总scs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润scs的比例比未治疗肿瘤高2倍(ctrlvs.rt=21.33±3.29%vs.44.10±3.00%，p<0.001)。p-scs与总scs具有相同的增加趋势(ctrlvs.rt=16.37±2.47%vs.38.66±4.24%，p<0.001)，而sc比例保持在约0.1%，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。
为了确定受照射肿瘤中p-sbsp;的逐渐积累是否有助于llbsp;肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗ly-6g单克隆抗体来消耗sbsp;.抗ly-6g抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中p-sc的频率（p<0.05）。此外，用抗ly-6g抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明p-sc的募集对肿瘤再生至关重要。
虽然p-scs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对cd8+t细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定rt后p-sbsp;诱导的免疫抑制是否依赖于bsp;+t细胞，我们通过流式细胞术评估了bsp;+t细胞的数量和功能。
如图3d所示，bsp;+t细胞的百分比随着照射从11.71±2.31%下降到2.42±0.62%(p<0.01)。p-sc耗竭逆转了这种下降（rt+anti-ly-6g抗体=2.42±0.62%vs.20.12±3.92%，p<0.01）。为了更好地了解bsp;+t细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了cd8+t细胞内部和表面上ifn-γ、cd28和pd-1的表达。局部rt显着降低了bsp;+t细胞分泌ifn-γ的比例，从33.064.53%降至13.252.08%，并增加了表达pd-1的bsp;+t细胞的比例（ctrlvs.rt=253.20±57.03auvs.538.80±98.76）au，p<0.05）。
cd28表达未观察到显着变化。当抗ly-6g抗体被给予辐照小鼠时，ifn-γ分泌达到与未处理的llbsp;小鼠相同的水平（29.74±3.55%），而与辐照小鼠进行比较抗ly-6g抗体处理后的pd-1表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议p-sbsp;通过抑制bsp;+t细胞促进放疗后肿瘤的再生。p-sbsp;不仅抑制了t中bsp;+t细胞的数量，而且还抑制了其活性。
为了确定辐照诱导scs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及in1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部rt增强了arg1的表达，但没有增强inos的表达。arg1活性测定表明，局部照射显著提高了arg1的活性，从0.400.15u/l提高到3.780.39u/l((p<0.01)。相比之下，no荧光标记的inos活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。
pd-l1的表达是sbsp;的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问pd-l1上调是否是rt后sbsp;介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后sbsp;中pd-l1的表达。图4e显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的sbsp;中的pd-l1表达在照射后不久显着增加（照射后第三天：ctrlvs.rt=443.9±175.3auvs.1328.0±324.3au，p<0.05）.然而，此后pd-l1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（ctrlvs.rt=1，465.0±399.6auvs.407.5±164.8au，p<0.05）。外周血中sbsp;的pd-l1表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。
以上数据表明arg1表达的上调是照射后p-scs抑制功能的合理机制。然而，不涉及pd-l1和inos的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予arg1抑制剂nor-noha。10/kg/dnor-noha有效地将arg1活性从3.780.39u/l降低到2.020.25u/l（p<0.01）。
rt后给予nor-noha显着增加cd8+t细胞比例（rtvs.rt+nor-noha=2.420.62%vs.6.140.64，p<0.01），并伴有肿瘤再生延迟。inos抑制剂1400w对肿瘤再生长没有影响。
我们的结果表明，rt通过上调肿瘤内p-sbsp;的百分比和arg1活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制p-sbsp;及其arg1活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，pde5抑制剂可以抑制tb小鼠和癌症患者sbsp;中inos和arg1的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20/kg/d，以研究它是否可以促进rt的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5b所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照nor-noha相当。t的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内p-sbsp;的比例从38.66±4.24%下降到23.57±2.38%。
此外，西地那非也显着降低了arg1的表达。为了进一步检查西地那非对sbsp;的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内bsp;+t细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明bsp;+t细胞的百分比从2.42±0.62%增加到7.21±1.22%。
此外，当给予西地那非时，bsp;+t细胞分泌的ifn-γ也显着升高。因此，我们证实pde5抑制剂西地那非通过调节p-sbsp;改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。
工作揭示了p-scs中arg1通路介导rt后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，p-scs是辐照招募的主要亚型，而不是scs。在广泛的免疫抑制机制中，arg1的上调和激活是p-scs在放疗后抑制cd8+t细胞的主要机制。为了克服p-scs引起的免疫抑制，我们提出并证明，sildenafil和rt联合使用降低了p-scs在t内的募集和免疫抑制作用，激活了cd8+t细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制t以提高rt治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在llc小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，scs及其亚型如何影响t仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。
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